1. 由于BEH HILIC色譜柱不含有鍵合相，因此pH操作范圍為1~9，操作溫度上限為45 ℃。

2. 與其他液相色譜柱一樣，BEH HILIC色譜柱在pH、壓力和溫度的極值下運行會縮短色譜柱使用壽命。

色譜柱平衡

1. 初次使用本色譜柱時，用50倍柱體積的50%乙腈: 50%水溶液（含最終濃度為10 mM的緩沖液）平衡色譜柱。

2. 初次進樣之前，用20倍柱體積的流動相（初始條件）平衡色譜柱。

3. 如果采用梯度條件，在進樣之間用8~10倍柱體積的流動相平衡色譜柱。

4. 色譜柱平衡不當會導致保留時間漂移。

流動相注意事項

1. 流動相或梯度中應始終保持至少3%的極性溶劑（例如3%水/3%甲醇或2%水/1%甲醇等）。這樣可以確保ACQUITY BEHHILIC顆粒始終保持水合狀態(tài)。

2. 流動相或梯度中應始終保持至少40%的有機溶劑（例如乙腈）。

3. 避免在HILIC流動相中使用磷酸鹽緩沖液以防止出現(xiàn)析出，但可以使用磷酸。

4. 相較于甲酸或醋酸等添加劑，使用諸如甲酸銨或醋酸銨的緩沖液可獲得重現(xiàn)性更好的結果。如果只能使用添加劑（例如甲酸等）而不是緩沖液，請使用0.2% (v:v)的濃度，而不是0.1%。

5. 為了獲得理想峰形，應始終保持流動相/梯度中含有濃度為10 mM的緩沖液。

進樣溶劑

1. 如果可能，進樣溶劑應使用95%乙腈。極性溶劑（如水、甲醇和異丙醇）應減少到總體積的25%。

2. 通用的進樣溶劑為75:25乙腈/甲醇，該溶劑可以很好地平衡分析物溶解性和峰形。

3. 請避免進樣溶劑中含水和二甲基亞砜(DMSO)，這些溶劑將導致非常差的峰形。

4. 通過反相固相萃取(SPE)用乙腈置換掉水或DMSO。如果無法實現(xiàn)，則用有機溶劑稀釋水或DMSO。

其他技巧

1. BEH HILIC色譜柱專用于保留極性非常強的堿性化合物，而對于酸性、中性和/或非極性化合物的保留性能有限。

2. 分析小分子(< 200 Da)強極性堿性化合物時，理想流速范圍為0.4~0.8 mL/min。

3. 相較于Atlantis™ HILIC硅基HPLC色譜柱，BEH HILIC色譜柱在梯度分析中的保留性降低20%，在等度分析中的保留性降低35%~65%。這是因為BEH顆粒表面的硅醇殘基濃度更低。

4. 切記水在HILIC分析中是非常強的溶劑。因此，必須去除或盡可能減少進樣溶劑中的水。

5. 初步探索色譜條件時，可運行95%乙腈至50%乙腈的梯度。若無保留，可運行95:3:2乙腈:甲醇:水相緩沖液的等度條件。

6. 可使用諸如甲醇、丙酮或異丙醇之類的極性溶劑代替水以增強保留性能。

7. 如果使用ACQUITY UPLC系統(tǒng)，弱洗針液應嚴格按照初始流動相條件中的有機相百分比配制，否則分析物峰形或保留性能可能會受到影響。

8. 建議通過在工作流程中加入HILIC質量控制(QC)參比物質來監(jiān)控系統(tǒng)的運行狀況。